Cell Meter Caspase 9活性細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是通過測量Caspase 9的活性而用于細(xì)胞凋亡檢測的。Caspase 9是CED-3亞家族中的一員?；罨腃aspase 9能切割下游caspases,例如caspase-3,-6和-7，起始caspase級聯(lián)反應(yīng)。在正常發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，活化的Caspase 9是凋亡所必需的。Caspase 9已證明具有底物的選擇性，其基序?yàn)長eu-Glu-His-Asp (LEHD)。本試劑盒利用(Ac-IETD)2-R110作為熒光指示器來檢測caspas-9的活性。通過caspas-9的切割R110肽產(chǎn)生強(qiáng)綠色熒光，其發(fā)射光在520 nm和530 nm之間，激發(fā)光為480 nm和500 nm·之間。本試劑盒提供所有必需組分和最佳操作流程。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，快速且適應(yīng)高通量篩選。它不僅能夠定量凋亡細(xì)胞中caspas-9的活性還能篩選caspas-9的抑制劑。

工作溶液配制

將50μLCaspase9底物（組分A）加入10mL測定緩沖液（組分B）中并充分混合。

操作步驟

1.通過將10μL/孔的10X測試化合物（96孔板）或5μL/孔的5X測試化合物（384孔板）加入PBS或所需緩沖液中來處理細(xì)胞。 對于空白孔（沒有細(xì)胞的培養(yǎng)基），加入相同量的化合物緩沖液。

2.將細(xì)胞板在5％CO 2,37℃培養(yǎng)箱中孵育所需的一段時(shí)間以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的半胱天冬酶9工作溶液。

4.將工作溶液板在室溫下孵育至少1小時(shí)，避光。 注意：如果需要，在室溫下加入測定加樣溶液10分鐘前，向選定的樣品中加入1μL的1 mM Ac-LEHD-CHO caspase 9抑制劑，以確認(rèn)對caspase 9樣活性的抑制。

5.將細(xì)胞板（特別是非貼壁細(xì)胞）以800rpm離心2分鐘（關(guān)閉制動(dòng)器）。

6.監(jiān)測Ex / Em = 490 / 525nm處的熒光強(qiáng)度