MUP二鈉鹽是磷酸酶的熒光底物，它廣泛地用于溶液中磷酸酶的檢測(cè)。然而這種磷酸酶底物并不適用于活細(xì)胞或者連續(xù)性分析，因?yàn)镸U(4-甲基傘形酮)，酶促反應(yīng)產(chǎn)物，只有在PH>10時(shí)才發(fā)出最大熒光。因此用MUP檢測(cè)酸性范圍內(nèi)磷酸酶仍然是個(gè)難題，例如檢測(cè)酸性磷酸酶。AAT Bioquest很高興為大家提供MUP Plus，它與MUP底物相聯(lián)系克服了其pH的限制性。

實(shí)驗(yàn)方案

1.準(zhǔn)備工作：

1.1在升值溶劑中制備2至10 mM的儲(chǔ)備溶液。 應(yīng)立即使用原液。 任何未使用的溶液需要等分并在<-20℃冷凍。

注1：不要使用DMSO，ETOH或METH制備SunRed?磷酸鹽的儲(chǔ)備溶液，因?yàn)樗鼤?huì)顯著增加分析背景。

注2：避免反復(fù)凍融循環(huán)，避免光照。

1.2制備2X磷酸鹽工作溶液：在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將底物溶解在升值溶劑中或在室溫下解凍等份的儲(chǔ)備溶液（來自步驟1.1）。 在100 mM Tris緩沖液或您選擇的緩沖液（pH 8至9）（非磷酸鹽緩沖液）中制備10至50μM的2X工作溶液。

2.在上清液中進(jìn)行磷酸酶測(cè)定：

2.1將50μL2X磷酸鹽工作溶液（來自步驟1.2）加入磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中，使總磷酸酶測(cè)定體積為100μL/孔。

注意：對(duì)于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μL2X磷酸鹽工作溶液。

2.2在所需溫度下孵育反應(yīng)30至120分鐘，避光。

2.3用熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)適當(dāng)濾光片組的熒光增加。

2.4空白孔中的熒光（僅含測(cè)定緩沖液）用作對(duì)照，并從具有磷酸酶反應(yīng)的那些孔的值中減去。